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Ainda na universidade, Sydney Bristow foi recrutada para trabalhar para a SD-6, uma agência secreta que ela pensava pertencer ao governo. Mas quando seu namorado é assassinado por agentes da SD-6, ela descobre que a corporação é, na verdade, uma agênCIA inimiga. Sydney então se aproxima da CIA para se vingar da SD-6 e se transforma em uma agente infiltrada que participa das missões da SD-6, mas repassa todas as informações à CIA. Com sua admissão na mais importante agência secreta americana, o agente Michael Vaughn lhe revela a existência de uma outra pessoa infiltrada na SD-6: Jack Bristow, seu pai, um homem que ela mal conhece.Trabalhando em sigilo absoluto e enfrentando grandes riscos e missões que exigem exímia inteligência e rapidez, Sydney acaba conhecendo melhor o seu pai e descobre que nem tudo em sua vida era o que imaginava. A série acabou em 2006, depois de cinco temporadas.
Sydney Bristow descobre que seu emprego como agente da <I>SD-6</I>, uma divisão ultra-secreta da <I>CIA</I>, guarda alguns segredos que ameaçam a segurança do mundo. Apesar de ser avisada dos perigos que o trabalho envolve, Sydney revela seu segredo ao seu noivo, Danny, que acaba sendo assassinado. Sydney descobre que seu pai, Jack, é também um agente da <I>SD-6</I> e que a divisão não faz parte da <I>CIA</I>, mas sim um inimigo dos Estados Unidos. Sydney pede ajuda à verdadeira <I>CIA</I> e é denominada agente infltrada sob o comando do oficial de operações Vaughn. Agora, sua obrigação é completar as missões da <I>SD-6</I> enquanto repassa suas descobertas à <I>CIA</I>. Mas quando Sydney descobre que seu pai também é um agente da <I>CIA</I>, ela começa a questiona se sua lealdade à <I>CIA</I>, ela começa a questionar onde ela deverá depositar sua verdadeira lealdade.
Sydney volta à <I>SD-6</I> e é designada para viajar com Dixon para Moscou para recuperar arquivos roubados. Mas quando Sydney descobre que permitiu que a <I>SD-6</I> tivesse acesso a armas nucleares, ela é forçada a viajar para Cairo e encarar um terrível inimigo. Enquanto isso, Will começa a questionar as circunstancias que cercam a morte de Danny e Sydney descobre qual foi o envolvimento de seu pai no assassinato.
Sydney se encontra em grande perigo quando é mandada para Madrid para encontrar um desenho de uma arma de 500 anos que contém uma combinação de números e se depara com sua inimiga mortal, a agente da <i>K-Directorate</i> Anna Espinosa. Will se aprofunda cada vez mais sobre a causa da morte de Danny e descobre uma anomalia.
Sydney e Dixon participam de um caso perigoso envolvendo a segurança da <i>Organização Unida do Comércio</i>. Francie confronta Charlie sobre seu encontro secreto com outra mulher e Will continua a se aproximar da verdade sobre o assassinato de Danny.
A vida secreta de Sydney como agente infiltrada é colocada em risco depois do contrabando de um engenheiro biotécnico da <I>SD-6</I> na sua missão em Berlim. Will encontra uma mulher que confessa ter tido um caso com Danny pouco antes sua morte. Vaughn informa Sydney que seu pai pode estar trabalhando para uma terceira agência de operações secretas.
Sydney se disfarça e vai a uma instituição mental para obter informações sobre Shepard, um homem que tem sido programado inconscientemente para ser um assassino mortal. Enquanto isso, Sydney se convence que seu pai foi responsável pela morte de sua mãe há 20 anos. Will descobre a verdadeira identidade da mulher que alegava ter tido um caso com Danny e Francie fica aliviada ao saber que Charlie não está saindo com outra mulher. Marshall encontra o vírus instalado pela <I>CIA</I> no computador principal da <I>SD-6</I>.
Enquanto ajuda Shepard a escapar de um asilo em Bucareste, Sydney descobre a surpreendente conexão que os dois tiveram no passado. Depois de rastrear secretamente o vírus instalado pela <I>CIA</I>, Sloane é confrontada pelo representante da Alliance, Alain Christophe, que sugere que um ou mais espiões podem estar infiltrados na <I>SD-6</I>. Will continua a investigar a mulher que alegava ser a amante de Danny e Sydney descobre a verdade sobre o envolvimento de seu pai na morte de sua mãe há 20 anos atrás.
Sydney deve se submeter a um extensivo teste para detectar mentiras para satisfazer a frenética busca de Sloane pelo espião da <I>SD-6</I>. Enquanto isso, Sydney procura pela conexão que um equipamento pode ter com um desenho de 500 anos da idade do profeta Rambaldi. O mistério de Kate Jones se aprofunda à medida que Will continua a investigar a morte de Danny e Sydney descobre que uma lembrança de sua mãe Laura contém mais conexões perturbadoras em relação ao passado de Jack.
A vida de Sydney é colocada em grande perigo quando Sloane é informado pelo seu superior que ela é a infiltrada na <I>SD-6</I>. A vida de Dixon fica por um fio depois que ele recebe um tiro numa missão e Will percebe que ele pode descobrir algumas informações inesperadas com o chip de Kate Jones.
Syd vai parar em uma câmara de tortura da <I>SD-6</I> depois que seu disfarce cai; Will localiza o único homem que sabe a verdade sobre Kate Jones e a fita misteriosa; Vaughnse preocupa com o presente de Natal para seus colega e Jack vai a Havana para desfazer um negócio com o inimigo de Sloane mais procurado.
Sydney se sente agradecida por seu pai ter salvado sua vida durante uma missão em Havana. Mas sua admiração dura pouco quando Vaughn descobre fortes evidên<i>CIA</I>s de que Jack pode ter sido o responsável pela morte de uma dúzia de oficiais da <I>CIA</I> há muitos anos.
Quando intrusos armados invadem a <I>SD-6</I>, liderados para McKenas Cole, um homem desiste de se vingar do ex-chefe Sloane. Sydney e Jack devem trabalhar juntos para salvar os colegas. Enquanto isso, Will teme que sua investigação da <I>SD-6</I> e sua ligação ao assassinato de Eloise Kurtz está colocando sua vida em risco.
Vaughn desobedece ordens e tenta ajuda Sydney e Jack a evitar a destruição do quartel general da <I>SD-6</I> e seus ocupantes. Cole continua com sua vingança contra Sloane e procura por um equipamento misterioso. Uma mulher desesperada, porém determinada, convence Will a continuar sua investigação da <I>SD-6</I> e a prender David McNeil.
Enquanto a equipe por trás do ataque do <I>SD-6</I> mira nos grupos de inteligência rivais de Sloane, Dixon e Syd vão a Lãs Vegas para observar o K-Dictorate, que pode ser o próximo da fila a receber uma visita letal. Mas a missão deles fica comprometida pela chegada inesperada de Francie e seu noivo. Jack tem a chance de fazer o papel de pai, já que sua filha está tendo dificuldades em decidir seu futuro educacional.
Will paga um preço caro por trabalhar com McNeil para expor a SD-6; Vaughn pede a Syd para explorar a amizade dela com a esposa doente de Sloane e roubar uma página do manuscrito de Rambaldi que está trancado na casa de seu chefe. Francie decide que é hora de superar o fim de seu romance com o infiel Charlie.
Sydney é testada pelo DSR na tentativa de descobrir sua ligação misteriosa com uma assustadora foto de 500 anos de idade e um manuscrito feito por um profeta. Enquanto isso, Sloane descobre por meio de um membro da Aliança dos Doze que um amigo próximo pode estar de mãos dadas com um inimigo.
Enquanto o FBI detém e questiona Sydney sobre seu passado e possíveis laços com uma profecia misteriosa, Vaughn e Jack devem correr para liberá-la e descobrir uma maneira de limpar seu nome antes que sua máscara caia e a <I>SD-6</I> descubra a verdade. Sydney descobre uma prova de que os escritos do profeta Rambaldi podem conter outras verdades sobre uma arma de destruição em massa – e o destino de sua família.
Uma antiga paixão de Syd reaparece para ajudá-la a roubar um equipamento que pertence a um homem que guarda a chave do trabalho de sua mãe na KGB e possíveis locais de missão. Os confusos laços de família de Jack começam a atrapalhar seu estado mental; Will e Francie encontram uma passagem de avião que as deixa com medo de que seu amigo tenha algo a esconder.
Syd fica indecisa entre seguir seu coração e encontrar sua mãe depois que Noah oferece a ela um jeito de sair da <I>SD-6</I> assim que a fita da KGb de Irina Derevko aparece. Mas assim que ela toma sua decisão, um assassino aparece para fazê-la mudar de idéia. Enquanto isso, Will e Francie confrontam Syd para tentar descobrir algo sobre seus planos secretos de viagem; Vaughn começa a esconder as informações de seus agentes do FBI e Jack procura a ajuda de Barnett.
Syd e Vaughn fazem uma armadilha para Khasinau com um relatório sobre a existência de uma segunda dose do soro de Rambaldi; a esposa de Sloane conta um pequeno segredo a Syd e coloca sua própria vida na fila para o processo. Will confronta Jack sobre seu seqüestro seguindo uma ligação de um informante anônimo.
Will faz uma descoberta surpreendente enquanto ajudava Jack a desmascarar o Garganta Profunda em Paris, onde Syd está pronta a realizar uma mudança de planos para Khasinau com a ajuda do capturado Sark. Enquanto isso, Dixon começa a suspeitar de seu parceiro; a Aliança recruta Sloane para o plano de eliminar Emily e Vaughn começa a se afastar de seu agente favorito para salvar a vida dele – e dela também.
Jack e Sydney se opoem à <I>CIA</I> e a <I>SD-6</I> ordena que um espião de uma das agências leve Sark diretamente ao cofre de Will. Vaughn toma uma decisão que muda o rumo de sua carreira baseada nos achados do diário secreto de seu pai. Sloane percebe que a absolvição de Emily a tornou uma mulher marcada. Dixon confronta Syd sobre seu emprego paralelo e Khasinau revela o resultado final dos desenhos de Rambaldi.
